阿托伐他汀抑制大鼠心肌肥大的实验研究
位置: 首页 >范文大全 > 公文范文 > 文章内容

阿托伐他汀抑制大鼠心肌肥大的实验研究

2022-04-14 09:50:46 投稿作者:网友投稿 点击:

收稿日期:20051227

基金项目:受自然科学基金资助(编号:30270551),军队十五面上项目(编号:02M012)

作者单位:100853北京市,解放军总医院老年心血管二科(叶平、盛莉、张铖、张秀锦);100037北京市,海军总医院心内科(王兆君)

作者简介:叶平,女,1953年12月生,浙江省杭州市人,医学博士,教授,主任医师,科主任,Tel:01066939635, Email:yeping@sina.com

【摘要】目的通过体外心肌细胞培养和在体动物实验方法,观察阿托伐他汀对大鼠心肌肥大的抑制作用,以及对心肌中炎性细胞因子的影响,探讨该类药物影响心肌肥大可能涉及的作用机制。方法 体外原代培养新生大鼠的心肌细胞,以血管紧张素Ⅱ刺激建立心肌肥大模型,给予不同浓度的阿托伐他汀处理。采用RTPCR法检测脑钠素(BNP)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和白细胞介素1β(IL1β) mRNA的表达,并以3H亮氨酸掺入测定心肌细胞蛋白合成速率。在体实验中通过不完全结扎大鼠的腹主动脉,使压力过度负荷增加造成左心室肥厚,以阿托伐他汀治疗4周,RTPCR检测IL1β,心调理素1(CT1)的表达,并观察心脏的病理学改变。结果 心肌细胞肥大模型出现后,心肌细胞的BNP、MMP9和IL1β mRNA的表达以及蛋白合成速率增加。经不同浓度的阿托伐他汀处理后,这些变化得以减轻。阿托伐他汀抑制压力负荷升高引起的左心室心肌BNP, IL1β,CT1的mRNA表达的增加,并减轻大鼠心脏重/体重比值、左心室壁厚度和心肌细胞平均直径的增加。结论 阿托伐他汀可能通过抗炎作用抑制大鼠心肌肥大,对防治以心肌肥厚为特征的心血管疾病可能有一定的应用前景。

【关键词】3羟3甲戊二酰辅酶A还原酶;细胞因子;心肌肥厚

他汀类药物是3羟3甲戊二酰辅酶A(3hydroxy3methylglutarylCoA,HMGCoA)还原酶抑制剂,能够通过抑制HMGCoA还原酶的活性来抑制胆固醇的合成,从而发挥降低血胆固醇的作用。除此之外,近年的研究还发现这类药物有降脂以外的许多作用,例如:抗炎作用,稳定动脉粥样硬化斑块,保护血管内皮等。因各种原因引起的心肌肥厚与多种心血管疾病发展过程有关,是心肌缺血、心律失常和心性猝死的独立危险因素。业已证明,心肌肥厚发展过程中炎性细胞因子发挥了重要作用,但关于他汀类药物对心肌细胞炎性因子表达和心肌肥厚的作用国内报道较少。本研究在体内外实验研究中观察阿托伐他汀对心肌肥厚的影响,以探讨阿托伐他汀在治疗心肌肥厚中的作用及其可能涉及的作用机制。

1材料与方法

1.1动物和试剂

SD大鼠由解放军总医院实验动物中心提供。 高糖DMEM干粉培养基、新生小牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司;血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)购自 Sigma公司;RTPCR试剂盒、DNA Marker DL2000购自TaKaRa公司; 3H亮氨酸购自北京原子高科技术应用股份有限公司。阿托伐他汀由辉瑞制药有限公司提供。

1.2引物引物由北京赛百胜生物工程公司合成(表1)。

1.3心肌细胞原代培养及模型建立

无菌条件下开胸取出SD乳鼠(2~4d)心脏,剪碎至1~3 mm3大小,以0.08%的胰蛋白酶消化5 min左右,10%牛血清培养液终止消化,反复数次,直至碎片完全消化。将细胞沉淀以培养液悬浮,悬液收集于50 ml培养瓶中,差速贴壁60 min后,吸取未贴壁细胞至新培养瓶(板)中。心肌细胞在5% CO2、37℃条件下培养48 h,然后无血清培养24 h,在以AngⅡ(1 μmol / L)诱导心肌细胞肥大前60 min分别加入不同浓度的阿托伐他汀(0, 0.1, 1, 10μmol / L),然后继续培养48 h。

1.4心肌细胞3H亮氨酸的掺入测定

以台盼兰染色计数活细胞,用10%牛血清培养液调整心肌细胞至5×108 cell/L,接种于12孔板,1.5 ml/孔,各孔分别加入不同处理因子和37 kBq 3H亮氨酸。 48 h后沉淀蛋白,收集沉淀物到玻璃纤维滤膜上。烘干滤膜, 放入闪烁瓶中, 加入闪烁液3 ml, 用LS6500液体闪烁计数仪进行掺入量的测定,反映了心肌细胞的蛋白合成速率。

1.5大鼠左室肥厚模型的建立及分组

雄性SD大鼠24只(体重180~200 g),分为3组: A组和B组为左心室肥厚组,经10﹪水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔麻醉后行剑突下正中切口,于双侧肾动脉分支近心端处将腹主动脉与直径为0.6mm的钢丝结扎在一起后,然后抽出钢丝,缝合切口,术后存活4周。C组为对照组。A组于手术前1周起用灌胃器经口给予阿托伐他汀(每天5mg/kg体重 ),直至术后4周;B组在同样的时间灌0.9﹪生理盐水直至术后4周。C组既不手术也不灌药与其他两组在相同的环境下饲养相同的时间。处死动物前称体重,处死后取心脏称重,计算心脏重/体重比值。

1.6病理学检测

将甲醛固定的心脏组织做成石蜡切片,经HE染色后拍照,用ImagePro Plus 图象分析软件测量左心室的前壁,侧壁,后壁和室间隔的厚度,计算左室壁平均厚度。在显微镜下放大40倍后再拍照,每张切片随机选取10个视野,每个视野选10个心肌细胞,用ImagePro Plus软件测每个心肌细胞的直径,取其平均值。体外培养的心肌细胞同样随机选取100个细胞,测定直径,取其平均值。

测定体外培养的乳鼠心肌细胞的脑钠素(brain natriuritic peptide, BNP),白介素1β(interleukin1β, IL1β),基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase, MMP9)mRNA的表达,大鼠左室心肌BNP,IL1β,心调理素(cardiotropin1,CT1)的mRNA表达。以TRIzol试剂一步法提取细胞总RNA。经DU640核酸分析仪检测纯度及浓度后,严格按照RTPCR试剂盒说明书操作。所用引物见表1。BNP和GAPDH的扩增条件为:95℃预变性5min;95℃ 45 s、48℃1 min、72℃1 min,28次循环;MMP9的条件为95℃ 45 s、54℃1 min、72℃1 min,28次循环;IL1β和CT1的扩增以94℃ 45s、55℃ 45s、 72℃ 90s、30次循环;PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下凝胶成像分析系统记录结果,待测基因 mRNA相对表达量以其扩增带光密度值与相应内参照扩增带光密度值的比值表示。

1.8统计方法

数据以均数±标准差(±s)表示。用SPSS统计软件,以Oneway ANOVA分析各组别之间的差异,组间比较采用 t检验。

2结果

2.1阿托伐他汀对心肌细胞表面积的影响

与正常心肌细胞相比,AngⅡ诱导的心肌细胞的表面积显著增加;阿托伐他汀在终浓度为10μmol/L时可明显逆转此改变,而作为溶剂的DMSO对AngⅡ介导的心肌细胞面积增加无逆转作用(P>0.05,图1)。阿托伐他汀对正常心肌细胞的表面积无影响(结果未给出)。

2.2阿托伐他汀抑制肥大心肌细胞3H亮氨酸的掺入

与正常心肌细胞相比,AngⅡ诱导的心肌细胞3H亮氨酸掺入量明显增加,阿托伐他汀抑制3H亮氨酸掺入,且呈一定的剂量依赖性,但对正常心肌细胞并无影响(P>0.05,图2)。DMSO对AngⅡ诱导的心肌细胞的3H亮氨酸掺入无影响(P>0.05)。

2.3阿托伐他汀抑制压力过度负荷性左心室肥厚

腹主动脉缩窄造成压力过度负荷(B组)4周后,大鼠心脏重/体重值,左心室壁平均厚度,心肌细胞平均直径较对照组(C组)有明显增加,而腹主动脉缩窄并应用阿托伐他汀治疗的A组的上述指标较B组有显著改善(表2)。

2.4阿托伐他汀抑制大鼠心肌细胞因子的表达

体外心肌细胞培养显示,与正常心肌细胞相比,AngⅡ刺激的心肌细胞肥大特征性基因BNP mRNA表达明显

1:正常组,2:AngⅡ模型组, 3:AngⅡ+DMSO, 4:AngⅡ+阿托伐他汀(10μmol/L); 与正常组比,* P<0.01;与模型组比,# P<0.01

图各组体外培养心肌细胞的3H亮氨酸掺入

3HLeu为3H亮氨酸; Ator(0.1)、Ator(1)、Ator(10)均为不同浓度的阿托伐他汀(单位:ml/L); 与正常组相比,* P<0.01; 与模型组比较,#P<0.01 

增加,并且MMP9和IL1β mRNA表达也明显增加,阿托伐他汀抑制其表达。DMSO对模型组的心肌细胞上述基因的mRNA表达无影响(P>0.05,图3)。阿托伐他汀对正常心肌细胞的上述mRNA表达并无影响(结果未给出)。

图阿托伐他汀对心肌细胞BNP、IL1β及MMP9的mRNA表达的影响各指标mRNA的OD比值分别是各指标与内参照GAPDH电泳条带光密度比值;与正常组比较, * P<0.01; 与模型组比较,#P<0.01

在体试验,C组大鼠的左心室心肌中未检出IL1β,CT1和BNP的mRNA表达,而左心室肥厚的B组大鼠的心肌中IL1β,CT1以及BNP的mRNA有显著表达,应用阿托伐他汀治疗的A组大鼠心肌中上述基因的表达较B组明显降低(P<0.05,图4)。

图阿托伐他汀对左室肥厚大鼠心肌BNP、IL1β及CT1的mRNA的表达的影响与B组比较,*P<0.01

3讨论

心肌肥厚是心脏对机械负荷及神经体液因子改变的代偿性反应,可见于高血压病、心肌梗死、心脏瓣膜疾病等多种心血管疾病。临床研究表明,心肌肥厚不仅是心衰前的一种适应性反应,而且是发生心肌缺血、心律失常和猝死的独立危险因子。本实验研究显示,阿托伐他汀作为一种有效的降脂药,可在体外能够抑制Ang Ⅱ诱发的新生大鼠心肌细胞肥大,并且在大鼠压力过度负荷性左心室肥厚模型中减轻左心室肥厚的程度,提示阿托伐他汀对心血管疾病,特别是对左心室肥厚有潜在的保护作用。

研究发现,炎症与心肌肥厚的发生和发展过程密切相关。氯化钠敏感型Dahl大鼠喂高氯化钠的饲料引起血压升高,当形成左心室肥厚时,心肌中炎性细胞因子IL1β,CT1的mRNA和蛋白质的表达增加[1,2],当发展为心力衰竭时其表达进一步增加,而且与心脏重/体重比值呈正相关。IL1β在体外能够诱导心肌细胞肥大,使心肌肥厚的标志基因BNP表达增加[3]。CT1可以通过调节Ang Ⅱ的表达引起心肌细胞肥大[4]。MMPs是一组能特异地降解细胞外基质成分的锌依赖的酶家族。成熟的左心室心肌细胞在左室重构的过程中加速合成和分泌MMPs[5]。炎性因子通过自分泌的形式在心脏局部产生明显浓度变化,因而决定了它们在心肌肥厚的发生发展中起到重要的直接作用。

本文采用体外心肌细胞培养和在体动物实验建立心肌肥大模型,观察到MMP9、IL1β和CT1等炎性细胞因子,以及心肌肥厚的标志基因BNP的mRNA在心肌细胞的表达显著升高,经阿托伐他汀治疗后,多种炎性因子以及BNP的mRNA表达明显降低,且与阿托伐他汀抑制体外心肌细胞肥大和压力过度负荷性左室壁增厚的程度相一致,提示阿托伐他汀在转录水平抑制炎性细胞因子的表达,其具有的抗炎作用可能是阿托伐他汀抑制心肌肥厚的机制之一。

阿托伐他汀作为HMGCoA还原酶抑制剂,通过抑制HMGCoA还原酶的活性,抑制胆固醇的合成,从而发挥有效的降脂作用。最近陆续出现有关他汀类药物与炎性细胞因子及心肌肥厚方面的报道,Ogata等[6]在体外实验发现:氟伐他汀可以抑制IL1β诱导的心肌肥大。核因子κB(nuclear factorκB,NFκB),转录信号转导和激活因子(signal transducers and activation of transcription,STAT)和活化蛋白1(activator protein1,AP1)是调节炎症反应的重要转录因子,调控多种炎性细胞因子的基因表达,在心梗后左室重塑过程中发挥重要作用[7]。Dechend等[8]的研究发现:他汀类药物通过降低NFκB,AP1等转录因子的转录调控活性,抑制炎性细胞因子的表达,同时还可以降低高血压大鼠的血压,缓解心肌肥厚,降低死亡率。

目前他汀类药物在临床上主要用于治疗高胆固醇血症,延缓动脉粥样硬化斑块的进展,有关抑制炎症反应对动脉粥样硬化的影响的研究近年来进展很快,但是关于他汀类药物对左心室肥厚影响的研究报道并不多。近年的研究还发现,他汀类药物有可能用于心力衰竭的治疗。小规模的临床研究显示,扩张性心肌病患者服用辛伐他汀,能够降低患者血清中IL6,TNFα等炎性细胞因子和BNP的浓度,改善心脏功能,减轻心力衰竭症状[9]。较大规模的临床回顾性分析表明,严重的慢性心功能不全患者(LVEF<40%)服用他汀类药物,心血管性死亡的发生率低于未服用他汀类者[10]。因此,研究他汀类对慢性心力衰竭的有益作用已成为心血管病研究领域中的新热点,本研究的发现为他汀类的新用途提供了有益的实验资料。但是,他汀类药物对左心室重塑和心力衰竭的作用,可能涉及的机制及其临床价值还有待于深入研究。


推荐访问:肥大 心肌 抑制 实验研究 大鼠

猜你喜欢